核糖核酸酶保护实验

核糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号；对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素－辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。

RPA是一种有力的工具，可用于检测在总RNA混合物中特定mRNA分子的表达。尽管操作比较复杂，但是这种方法可以在一次检测中分析多达25样品。敏感性和高通量的优点使得RPA在病原体的发现中显得非常有用。由RPA得到的结果，结合普通的形态学技术有助于阐明疾病的发生过程。

RPA有Northern Blot无法比拟的优势：

1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全

2.RPA比Northern Blot灵敏15－150倍，适合检测各种表达水平之基因

3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达

4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度

这个方法的的主要缺点如下：

1.这个实验的前提是你必须首先要把要研究的基因克隆于一个载体，要清楚插入片段的方向，该载体插入片段两侧有T3、T7或SP6的启动子位点。载体先要用合适的内切酶线性化，选择正确的体外转录试剂盒，转录出要研究的mRNA 的互补链，再纯化。总之RNA探针的制备够麻烦。

2.核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头，X片上什么都没有。

3.要用放射性同位素。从事生物研究的人谁不接触放射性物质？但是该方法中不同于一般的探针标记，体积小，防护容易。它需要做垂直板状PAGE，还要漂洗固定，粘有放射性的物质太多，如电泳的缓冲液、电泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盘。这还没有算上RNA探针标记及随后的纯化过程。




可能出现的问题及应对措施：

1.No Discrete Bands, Only Smears－－RNA degraded, or the the RNase Digestion was too harsh.Try reducing the concentration of RNase A to 1 mg/ml or digest for a shorter period of time. Check your RNA for condition.

2.Bands Too Large, High Molecular Weight Artifacts－－The RNase Digestion was inefficient and unable to effectively trim down the RNA:RNA duplexes.Try RNasing longer or increasing the RNase concentration. /Incompletely linearized template DNA.

3.Bands in the Negative Control Lane－－ Inefficent RNase Digestion (see above)/Sense template contaminating riboprobe/Insufficent DNase digestion of riboprobe.

4.Many Lower Molecular Weight Bands Under the Main Band－－There can either be premature stop sites in the probe leading to smaller probe sizes, therefore smaller products. This can also stem from overdigestion by RNase A which will break-up the duplexes if the concentration or digestion time is too long.

5.No Signal At All: You did generate an antisense probe right?

RPA和SAGE的相同点和不同点：

两者的相同点都在于根据不同的RNA分子有不同的特征序列，以此为依据，分析基因的表达情况；两者的不同点在于，具体检测RNA的原理不一样，相比较而言，前者利用RNase只消化单链RNA（即未与RNA probe结合的RNA分子）的特性，定性兼半定量分析特定（视合成的probe）基因的表达，后者是基于只需14bp长的核酸序列即可代表一个RNA分子，用扩增的方式，定性的研究可以检测到一个细胞内所有转录体的表达