细胞培养之仪器的消毒灭菌

一        消毒灭菌
1.        湿热消毒
◇        湿热消毒的要求
        使用压力蒸汽灭菌器进行湿热消毒。
①        消毒物品不能装得太满，物品之间应留有空隙，以利于消毒器内蒸汽的流动。
②        排气管要插入消毒器的槽内。若排气管断裂，要将排气管与排气阀调至同一位置。
③        玻璃器材使用端(管口、瓶口)要向下放置。
④        液体消毒时，用棉塞或插有针头的胶塞封瓶口。
⑤        加热前将放气阀摘子置垂直位(开放)，消毒器内空气随温度升高由此阀孔逸出，容器内冷空气
        随之排出。当水煮沸时，有一股较急的蒸汽冲出时，将放气阀摘子置水平位(关闭)。排除冷空
        气的另一种方法是：放气阀摘子置水平位(关闭)，加热，压力升至5磅时，将摘子置垂直位(开
        放)，冷、热空气先后排出(可用手试)。待压力指针回归零位时，放气阀摘子再置水平位(关
        闭)。
⑥        继续加热，当消毒器内升压至需要压力时，计时并使压力恒定。压力维持方法：用电加热时，
        可通过电源和灭菌器间的稳压器调节；没有稳压器时，用放气阀摘子自动排气调节；用煤气加
        热时，可调节火力维持压力。根据消毒物品种类不同所选择的消毒压力和时间也不同，一般物
        品(如布类、金属器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20分钟；橡胶制品为10磅10分钟；常规
        液体消毒15磅15分钟。一般认为在这种压力下1分钟内几乎可杀死所有微生物，但由于消毒物品
        的包装内仍可能留有冷空气，而使高压蒸汽不能达到消毒器的各部分，所以要延长消毒时间。
⑦        消毒完毕，待压力指针降至零位，再等数分钟，待放气阀摘子放完气后打开消毒器盖。液体瓶
        口棉塞换胶皮塞或拔去胶皮塞针头换新塞。
       
◇        湿热消毒的注意事项
①        不可用安全阀摘子排气。
②        消毒的过程中若出现漏气现象，可调节消毒器盖内的胶垫的位置。
③        灭菌完毕，不要急于取出消毒品，可利用消毒器的余热去除物品部分湿气，待半小时左右再移
        入干燥箱烘干。
       
2.        干热消毒
        这种消毒方法主要用于玻璃器皿消毒，一般温度在160℃维持90—120分钟就可以杀死芽胞，达到消灭包括细菌、芽孢在内的一切微生物的目的，还可破坏热原质。消毒完毕，待烘箱内温度冷却后再开门，避免因冷空气突然进入，烘箱内温度骤降引起玻璃器皿损坏。
       
3.        紫外线消毒
        紫外线直接照射消毒是各实验室常用的方法，主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。进行室内消毒时，紫外线灯应距地面2．5米，使各处有0．06微瓦能量的照射。当室内有尘土时，杀菌能力减弱，故其消毒环境应清洁无尘，并要求消毒空气湿度小于50％，才能达到杀菌效果。紫外线消毒时产生臭氧，对身体有害，故紫外线消毒停止后30分钟才可入室工作。目前有的实验室采用电子灭菌灯代替紫外灯进行空气消毒。
       
4.        滤过消毒
        大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。常用的除菌滤器有正压式和负压式两种。
◇        正压式(加压式)滤过消毒。
        正压式除菌滤器为金属结构，中间垫一种特制的混合纤维素酯微孔滤膜，其过滤速度较快，效果较好，被多数实验室采用。滤膜孔径有0．6微米、0．45微米、0．22微米三种规格。滤过除菌时，常使用0．22微米孔径的滤膜。滤器上下层各有一槽，放置硅胶垫圈，将滤膜压紧固定。
        滤膜使用时应注意：
①        滤膜薄且光滑，容易移动，安装时膜位置一定要放正。过分干燥的滤膜很脆，在高压或高温干
        燥时易破裂，因此安装前可先用三蒸水润湿滤膜。
②        为保证过滤效果，在使用时，每次垫两张滤膜，上面一张孔径为0．45微米，下面一张孔径为
        0．22微米，或两张均为0．22微米。
③        使用无齿玻片镊子夹取滤膜，以防止镊齿弄破滤膜。
④        加大压力时用力应均匀，用后打开滤器对光检查滤膜是否移动和有无破裂。
⑤        滤器湿热消毒，37℃干燥。滤膜用后丢弃。若过滤少量液体，可将小型针头滤器安装在注射器
        上使用。目前许多厂家有一次性针头滤器出售。国产针头滤器易污染。
⑥        不同厂家的滤膜质量有差异。
       
◇        负压式滤过消毒
        负压式滤过消毒常使用玻璃滤器。玻璃滤器以烧结玻璃滤板固定在一玻璃漏斗上做成，适于各种培养液的滤过除菌，但不宜滤过血清等粘稠液体，因为容易堵塞滤板孔。根据滤板孔径大小分为G0—G6几种规格，一般使用G6型(孔径为0．22微米)除菌。玻璃滤器漏斗接抽滤瓶，胶管连接抽滤瓶和抽气瓶，抽气瓶再与真空抽气泵相连，或 抽滤瓶用胶管与玻璃水泵相连。负压式滤过消毒的缺点是滤速较慢，清洗过程繁琐。
       
        负压式除菌滤器安装使用注意事项：
①        漏斗与抽滤瓶连接部位要旋紧，并用消毒布包紧连接部位，以保证瓶口不漏气。
②        当抽滤瓶内有负压形成时，先夹紧抽滤瓶下口与抽气瓶连接的胶管，再缓慢停止抽气，防止有
        菌空气倒回，污染滤液。自然滤过一段时间，待流速减慢可再行抽气。
③        当漏斗中剩余液体为50～100毫升时，夹紧下口胶管停止抽气，空气随液体自然滤过消毒进入瓶
        内，瓶内压力升高，真空解除。
④        拆除真空泵和抽气瓶连接装置，拆除漏斗与抽滤瓶连接部包布。
⑤        漏斗与抽滤瓶连接部位在火焰前方均匀烧灼后，两者分开，抽滤瓶斜放在超净台上，瓶口顺风
        向。
       
5.        消毒剂
        75％酒精、新洁尔灭、过氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒剂。0．5％的过氧乙酸在10分钟内可将芽孢菌和各种病毒杀死；乳酸蒸汽常用做无菌室内或周围环境的定期消毒；75％酒精常用于超净台的台面、器械、实验操作者的皮肤等的消毒，0．1％新洁尔灭用于对桌、椅、地面、皮肤、操作台面进行擦拭或浸泡消毒；0．1％洗必泰水溶液用于皮肤浸泡消毒。
       
6.        塑料器皿消毒
        塑料器皿不耐高温，清洗干净后用75％酒精(分析纯)浸泡过夜，灭菌三蒸水浸泡两次，每次10分钟，紫外线照射1小时，再经细胞基础营养液浸泡过渡后，供短期内使用。
       
7.        电离辐射消毒
        大包装塑料器皿或不能用上述方法消毒的试剂，可用电离辐射消毒。电离辐射消毒方式有两种：一种是用2．5百万拉德60Co产生的γ射线照射48～72小时；另一种是用大于5百万电子伏特的高能电子束照射。前者穿透能力强，处理效果可靠，后者适于较小物品的灭菌。消毒时由辐照中心专业人员操作。