第一节 DNA的复制(DNA Replication)
一、DNA复制的基本特性
1. 半保留性(Semi-Conservative)
Meselson-Stahl实验
2. 双向复制(一般)
复制起始点(origin)+两侧复制叉=复制单位(复制子, Replicon)
3.半不连续性(Semi-discontinuous)
前导链(leading strand)-连续合成
随从链(Lagging Strand)-不连续,由岗崎片段(okazaki fragment)连接而成.
二、DNA复制必需的成份(真核生物)
1.染色体DNA复制必需三种核苷酸序列①复制起点②着丝粒③端粒.
2． RNA引物(RNA Primer)
一般8-14nt.带游离3'-OH末端.
3.参加DNA复制的主要酶和蛋白质
① DNA聚合酶(DNA Polymerase)
真核DNA复制的主要酶DNA Pol a/δ.
功能:从5'-3'方向延伸与模板互补的子代链.
②引发酶(Primase)
与其他多种蛋白组成多蛋白复合体-引发体(Primosome).催化RNA引物合成和复制起始.
③DNA连接酶(DNA Ligase)
催化一个双链DNA的5'磷酸与另一双链DNA的3'-OH形成磷酸二酯键.
④DNA解链酶(DNA Helicase),打开DNA双链.
⑤增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen.PCNA)
辅助催化前导链合成.
⑥端粒酶(Telomerase)
末端复制问题。
端粒酶负责染色体末端(端粒)复制,是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白.其中的RNA成分是端粒复制的模板.(因此端粒是逆转录酶)
作用:维持端粒长度.
端粒酶活性可用基于PCR的“TRAP”（Telomerase repeat amplification protocol）法测定（Kim,N et al.,science,266,2011-2014(1994)
端粒与细胞寿命。
端粒、端粒酶与肿瘤的关系：绝大多数恶性肿瘤具有端粒酶活性但端粒缩短，但也有约5%的肿瘤无端粒酶活性且端粒较长。
端粒酶作为新的肿瘤标志和肿瘤治疗靶点.
第二节 DNA修复（DNA repair）
DNA修复是维持基因组完整性的重要机制，在保护基因组避免发生可能导致肿瘤或遗传疾病的突变中起关键的作用。
引起DNA损伤的因素：
1、 细胞内源性损伤因素：
DNA复制错误；自发损伤包括碱基互变异构、碱基脱氨（C→U、A→I）和碱基丢失等；氧化代谢副产物如活性氧物质（Reactive oxygen species，ROS）的攻击等。
2、 环境中的损伤因素：
辐射（含紫外线、X射线）产生胸腺嘧啶二聚体；化学致癌物（氧化脱氨，烷化剂或代谢活化物如苯并芘、黄曲霉素等产生碱基加合物）
一、碱基切除修复(Base excision repair、BER)
该途径中最关键的是必须通过一种糖苷酶(glycosylase)先除去变异碱基(如被氧化、烷基化或脱氨的碱基)，该糖苷酶催化连接损伤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解，释放游离碱基并在DNA中产生一个去碱基位点，然后由去嘌呤／去嘧啶(AP)核酸内切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等利用相对的一条正常链为模板进行修补合成。
BER途径中的重要糖苷酶：
(1)尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)，从DNA中除去尿嘧啶碱基；
(2)3—甲基腺嘌吟(3MeA)DNA糖苷酶，可修复烷化剂产生的损伤；
(3)负责修复DNA氧化损伤的糖苷酶（如Fpg／MutM DNA糖苷酶）
BER是修复内源性DNA损伤(自发水解、烷基化和活性氧攻击)的主要途径，因此对于降低自发突变的频率、防止肿瘤发生有重要作用。
二、核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair，NER)
首先由多聚体复合物识别损伤，再在损伤的两侧进行切除。随着DNA链被解开，包含损伤的单链片段释放出来，留下的缺口由DNA聚合酶填补，DNA连接酶封闭。该途径包括20种以上蛋白，可以修复紫外辐射诱导的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和(6—4)光产物((6—4)PPs)，以及一些化学物质产生的大加合物。
人的NER系统有关基因及其蛋白质产物功能。
NER系统缺陷与着色性干皮病（Xeroderm pigmentosum,XP）
NER可再分为二条子途径：
(1)全基因组修复(Global Genomic repair，GGR)途径：修复整个基因组内的损伤，其效率取决于损伤的化学特性、损伤部位的DNA序列和染色质结构。
(2)转录藕联修复(Trancsription—coupled repair，TCR，)：特异地修复基因组中具有转录活性(即表达)的基因的被转录DNA链上的损伤，该途径的 特点是依赖RNA聚合酶II催化的转录，其中的一些蛋白是普通转录因子TFIIH 的亚基。
三、错配修复(Mismatch repair)
负责修复DNA复制过程中由于错误掺入而产生的错配。
STR序列复制-模板链的滑动产生小的环状突出(loop)- 重复序列扩张（expansion）或丢失：微卫星不稳定性（microsatellite instability）
E coli中的MMR途径需要mutS,mutH,mutL和uvrD基因产物和特异性核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等。在酵母和人类已鉴定了mutS,mutH的多种同源物。遗传性非息肉性结肠癌（HNPCC）基因缺陷。
微卫性不稳定与肿瘤。新的肿瘤基因诊断标志。
四、重组修复(Recomhinant repair)
修复DNA的两条链均受损伤的部位的双链断裂或链间交连。
Further readings:
1 Wood RD，DNA repair in eukaryotes，Ann Rev Biochem，1996，65：135—167
2 Krokan HE,et a1., DNA glycosylase in the base excision repair of DNA．Biochem J，1997，325：1—16
3 Vrieling H，et a1., Transcription coupled repair and its impact on mutagenesis，Mutation Res，1998，400：135—142
第三节 重组(recombination)
重组的本质是基因的重排或交换.即2个DNA分子间或一个DNA分子的不同部位间,通过断裂和重接,交换DNA片段从而改变基因的组合和序列.
一.同源重组(Homologous recombination)
指DNA同源序列间的重组,常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间。 可通过同源重组将外源基因定位整合到细胞基因组中.
二.转座(transposition)
可移动的DNA元件(mobile DNA elements)
-转座元件(Transposable element).它是指那些可在DNA分子内
或DNA分子间转移的DNA片段.
转座元件的转移过程-转座
转座的特点:
1.转座后原来位置的转座元件序列仍然保留,但同时又把新合成的DNA 复本插入到另外一个位点.
2.转座过程需要转座酶(transposase).它催化断裂和重接两步连续的 过程(需要M2+)
3.转座元件插入位置的两茶有3-12bp的正向重复序列(靶序列),它是由于转座酶错位切割DNA造成的.这种短正向重复序列是存在转座元件的特征.
转座元件的分类
①转座子(transposon):通过DNA复制而转移的转座元件.
②逆转座子(retroposon)或返座子,通过RNA阶段实现转移的转座元件 (DNA→ RNA→ DNA→ 插入新位点)
逆转座子例:Alu.LINE1.逆假基因(retro-pseudogene)
转座的遗传效应-导致基因重排、插入、缺失。 |
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